Wprowadzenie i cel badania

Badanie “Biomarker Identification, Safety, and Efficacy of High-Dose Antioxidants for Adrenomyeloneuropathy” to pilotażowe, II fazowe, otwarte badanie kliniczne dotyczące stosowania wysokich dawek przeciwutleniaczy u dorosłych osób z adrenomieloneuropatią (AMN), wariantem choroby adrenoleukodystrofii sprzężonej z chromosomem X (X‑ALD). Celem głównym badania było określenie bezpiecznej i skutecznej dawki zestawu antyoksydantów oraz walidacja biomarkerów stresu oksydacyjnego i zapalenia, które mogą być użyte do monitorowania leczenia i progresji choroby w przyszłych, większych próbach.

AMN jest najczęstszą postacią X‑ALD u dorosłych, charakteryzującą się powoli postępującym niedowładem spastycznym kończyn dolnych, zaburzeniami czucia, problemami ze zwieraczami, bólem nóg i zaburzeniami seksualnymi. Dotychczas nie ma zadowalającego leczenia farmakologicznego, a badanie opisywane w artykule jest próbą translacji pozytywnych wyników badań na modelu myszy do ludzi.

Autorzy i ośrodek badania

Badanie zostało przeprowadzone przez zespół wieloośrodkowy, z główną rolą grupy Aurory Pujol w Hiszpanii, specjalizującej się w chorobach peroksysomalnych i leukodystrofiach. Pierwszymi autorami są Carlos Casasnovas i Montserrat Ruiz, którzy wnieśli równoważny wkład w projekt i realizację badania. Ostatnim, korespondencyjnym autorem jest Aurora Pujol, co wskazuje na centralną rolę jej zespołu w opracowaniu koncepcji, prowadzeniu badania i analizie wyników.

Badanie było single‑center (jedno ośrodkowe), prowadzone w szpitalu Bellvitge University Hospital w Hiszpanii, z zapleczem badawczym Bellvitge Biomedical Research Institute. Projekt uzyskał akceptację Hiszpańskiej Agencji Leków i Wyrobów Medycznych oraz lokalnej komisji bioetycznej, a całość była zgodna z Deklaracją Helsińską i zarejestrowana w ClinicalTrials.gov (NCT01495260).

Projekt badania i populacja pacjentów

Badanie miało charakter prospektywny, otwarty (bez grupy placebo), II fazy, z obserwacją pacjentów przez 2 lata (8 wizyt). Włączono 13 dorosłych osób z AMN (12 mężczyzn, 1 kobieta) w wieku od 24 do 64 lat, z potwierdzonym rozpoznaniem AMN na podstawie podwyższonych poziomów bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (VLCFA) oraz patogennej mutacji genu ABCD1.

Kryteria włączenia i wyłączenia

Do badania kwalifikowano:

  • dorosłych (≥18 lat) objawowych pacjentów z AMN,
  • z potwierdzonym podwyższonym poziomem VLCFA w osoczu,
  • z wykrytą mutacją w genie ABCD1.

Wyłączano m.in. osoby z:

  • aktywną zapalną postacią mózgową (zmiany z wzmocnieniem gadolinem),
  • istotnym deficytem poznawczym,
  • wynikiem w skali EDSS > 6,5 (bardzo zaawansowana niesprawność),
  • uczuleniem na związki pokrewne cysteinie,
  • ciężką chorobą wątroby, układu oddechowego lub innymi poważnymi odchyleniami w badaniach laboratoryjnych,
  • ciążą, laktacją lub potencjalną możliwością zajścia w ciążę.

Zastosowane leki przeciwutleniające i uzasadnienie

W badaniu zastosowano kombinację trzech doustnych przeciwutleniaczy:

  • N‑acetylocysteina (NAC) – związek zwiększający produkcję glutationu, jednego z głównych wewnętrznych przeciwutleniaczy organizmu.
  • Kwas alfa‑liponowy (LA) – antyoksydant wspierający pracę mitochondriów i udział w metabolizmie energii.
  • Witamina E (α‑tokoferol, vit E) – witamina rozpuszczalna w tłuszczach, chroniąca błony komórkowe przed uszkodzeniami oksydacyjnymi.

Dobór tej kombinacji wynikał z wcześniejszych badań na modelu myszy X‑ALD/AMN, w których połączenie tych antyoksydantów zahamowało postęp kliniczny i uszkodzenia aksonów, oraz poprawiło kluczowe procesy metaboliczne, takie jak produkcja energii, biogeneza mitochondriów, proteostaza i odpowiedź na stres retikulum endoplazmatycznego.

Schemat dawkowania: dawka A i dawka B

Ponieważ tak skonfigurowana kombinacja antyoksydantów nie była wcześniej stosowana u ludzi, zastosowano dwustopniowy schemat dawek ze względu na bezpieczeństwo.

Dawka A – niższa dawka początkowa

Na początku wszyscy pacjenci otrzymywali niższą dawkę, oznaczoną w artykule jako dawka A (dose A):

  • N‑acetylocysteina (NAC) – 800 mg doustnie, raz dziennie.
  • Kwas alfa‑liponowy (LA) – 300 mg doustnie, raz dziennie.
  • Witamina E (vit E) – 150 IU doustnie, raz dziennie.

Tę niższą dawkę stosowano przez 2 miesiące ciągłego leczenia.

Po zakończeniu 2 miesięcy podawania dawki A wprowadzono 2‑miesięczną przerwę w trakcie której nie podawano leków, a pobrane próbki krwi służyły do oceny biomarkerów uszkodzeń oksydacyjnych białek.

  • Jeśli biomarkery wracały do zakresu uznanego za prawidłowy (normalizacja), pacjent kontynuował leczenie w dawce A przez kolejne 12 miesięcy.
  • Jeśli biomarkery nie uległy normalizacji, pacjent przechodził na wyższą dawkę – dawkę B.

W praktyce tylko jeden pacjent (nr 8) osiągnął normalizację biomarkerów przy dawce A i pozostał na niej przez dalszą część badania; pozostali wymagali zwiększenia dawek na B.

Dawka B – wyższa dawka

Dawka B była wyraźnie wyższa niż dawka A i odpowiadała pojedynczym wysokim dawkom opisywanym wcześniej w literaturze:

  • N‑acetylocysteina (NAC) – 2400 mg doustnie, raz dziennie.
  • Kwas alfa‑liponowy (LA) – 600 mg doustnie, raz dziennie.
  • Witamina E (vit E) – 300 IU doustnie, raz dziennie.

Pacjenci przyjmowali dawkę B przez 3 miesiące.

Następnie ponownie wprowadzano 2‑miesięczną przerwę (washout) i oceniano biomarkery.

  • Jeśli po dawce B biomarkery się znormalizowały, pacjenci kontynuowali dawkę B przez kolejne 12 miesięcy.
  • Gdyby biomarkery nie uległy poprawie, pacjenta uznano by za niereagującego na leczenie i leczenie zakończono. W tym badaniu jednak żadnego pacjenta nie zaklasyfikowano jako niereagującego – wszyscy ostatecznie uzyskali poprawę wskaźników.

Schemat wizyt obejmował m.in. punkty M0 (przed leczeniem), M2 (po 2 miesiącach dawki A), M4 (po przerwie), M7 (po 3 miesiącach dawki B), M9 (po kolejnej przerwie), a następnie M10–M21 w trakcie długoterminowej fazy leczenia wybraną dawką.

Biomarkery stresu oksydacyjnego i ich ocena

Jakie biomarkery badano

Autorzy skoncentrowali się na ilościowych wskaźnikach uszkodzeń oksydacyjnych białek i DNA oraz na mediatorach zapalenia, aby obiektywnie ocenić wpływ antyoksydantów.

W osoczu mierzono:

  • AASA (aminoadipic semialdehyd) i GSA (glutamic semialdehyd) – produkty utlenienia aminokwasów, odzwierciedlające uszkodzenia białek.
  • CEL (Nε‑(karboksyetylo)‑lizyna) i CML (Nε‑(karboksymetylo)‑lizyna) – produkty gliko‑ i lipooksydacji, związane z zaawansowanymi produktami końcowymi glikacji
  • MDAL (Nε‑malonodialdehyd‑lizyna) – produkt peroksydacji lipidów (uszkodzenia tłuszczów w błonach komórkowych).

W moczu badano:

  • 8‑oxo‑dG (7,8‑dihydro‑8‑okso‑2‑deoksyguanozynę) – wskaźnik uszkodzeń oksydacyjnych DNA.

Wyniki dla stresu oksydacyjnego

Na początku badania pacjenci z AMN mieli istotnie podwyższone stężenia CML, CEL, MDAL oraz 8‑oxo‑dG w porównaniu z grupą kontrolną, a także trend ku większym wartościom AASA.

Po 2 miesiącach dawki A u większości pacjentów nie zaobserwowano wyraźnej normalizacji AASA ani 8‑oxo‑dG; wyjątek stanowił pacjent 8, u którego te parametry wróciły do normy.

Po przejściu na dawkę B i 3 miesiącach jej stosowania stwierdzono wyraźny spadek wszystkich markerów uszkodzeń oksydacyjnych, zarówno białek (CML, CEL, MDAL, AASA), jak i DNA (8‑oxo‑dG). Wartości uległy znacznemu zmniejszeniu, co autorzy interpretują jako dowód skutecznego „wyciszenia” stresu oksydacyjnego przez kombinację antyoksydantów.

Biomarkery zapalenia i ich zmiany pod wpływem leczenia

Co mierzono jako wskaźniki zapalenia

Autorzy rozszerzyli ocenę o kolejne grupy markerów:

  • Lipidy prozapalne w osoczu to pewne tłuszcze krążące we krwi, które rosną, gdy w organizmie toczy się stan zapalny. Do tej grupy należą 12S-HETE, 15S-HETE i TXB2 (tromboksan B2). To są cząsteczki powstające z kwasu arachidonowego – czyli tłuszczu, z którego organizm robi różne substancje potrzebne m.in. do uruchamiania reakcji zapalnej.
  • Cytokiny i białka zapalne w osoczu to małe cząsteczki, którymi komórki „rozmawiają” ze sobą podczas zapalenia. Należą do nich IL-6, TNF, IL-8, HGF, MCP1 i adiponektyna.
  • IL-6, TNF i IL-8 pomagają uruchamiać i podtrzymywać stan zapalny.
  • HGF i MCP1 też biorą udział w reakcjach organizmu na uszkodzenie lub zapalenie.
  • Adiponektyna działa raczej ochronnie, czyli pomaga uspokajać zapalenie.
  • Ekspresja genów w komórkach krwi (PBMC) oznacza, jak mocno komórki „włączają” dane geny. PBMC to skrót od jednojądrzastych komórek krwi obwodowej – należą tu głównie limfocyty i monocyty. W badaniu sprawdzano geny związane z zapaleniem, m.in. IFNA2, IL-37, IL-4, IL-10, IL-36A, IL-36RN, IL-13, CCR3, CXCL5, IL-9R i STAT1. Część z nich działa prozapalnie, a część hamuje zapalenie lub je reguluje.
  • Neopteryna w płynie mózgowo-rdzeniowym to wskaźnik, że w układzie nerwowym trwa aktywacja komórek odpornościowych. Płyn mózgowo-rdzeniowy to płyn otaczający mózg i rdzeń kręgowy. Gdy jest w nim dużo neopteryny, zwykle oznacza to, że w ośrodkowym układzie nerwowym, czyli w mózgu i rdzeniu kręgowym, dzieje się coś zapalnego. Taki marker badano też w innych chorobach neurologicznych, na przykład w chorobie Parkinsona.

Wyniki dotyczące zapalenia

Przed leczeniem pacjenci z AMN mieli podwyższone poziomy prozapalnych lipidów (12S‑HETE, 15S‑HETE, TXB2) oraz cytokin (IL‑6, TNF, IL‑8, HGF, MCP1) i obniżone poziomy adiponektyny – co potwierdza przewlekłe, niskiego stopnia zapalenie.

Po zastosowaniu antyoksydantów, szczególnie w dawce B, wykazano:

  • spadek poziomu prozapalnych lipidów (12S‑HETE, 15S‑HETE, TXB2),
  • spadek stężeń prozapalnych cytokin (TNF, IL‑8),
  • spadek ekspresji prozapalnych genów w PBMC (IFNA2, IL‑4, IL‑36A, CCR3),
  • wzrost poziomu adiponektyny (białko o działaniu ochronnym),
  • wzrost ekspresji IL‑10 – cytokiny o działaniu przeciwzapalnym.

Dodatkowo, poziom neopteryny w płynie mózgowo‑rdzeniowym był podwyższony przed leczeniem i zmniejszał się istotnie po leczeniu, co sugeruje redukcję zapalnej aktywności w OUN.

Ocena kliniczna: EDSS i 6‑minutowy test marszowy

Skala niesprawności EDSS

Do oceny niesprawności neurologicznej użyto rozszerzonej skali niesprawności (EDSS), powszechnie stosowanej m.in. w stwardnieniu rozsianym. Wynik EDSS uwzględnia wiele domen neurologicznych, ale w AMN szczególnie ważna jest zdolność chodzenia. W badaniu pacjenci mieli zróżnicowane wyniki EDSS – od 1,0 (łagodna niesprawność) do 6,5 (ciężka niesprawność, ograniczenie chodu). Na początku wykazano silną, odwrotną korelację między EDSS a dystansem pokonanym w 6MWT (im wyższy EDSS, tym krótszy dystans).

6MWT to prosty test funkcjonalny polegający na mierzeniu dystansu, jaki pacjent jest w stanie przejść w ciągu 6 minut. Jest dobrze zwalidowanym narzędziem oceny wydolności, stosowanym w wielu chorobach przewlekłych. Przed leczeniem pacjenci z cięższą niesprawnością (wysoki EDSS) pokonywali krótsze dystanse. Po zakończeniu całego okresu leczenia i obserwacji (ostatnia wizyta) odnotowano:

  • istotną poprawę dystansu w 6MWT u 8 pacjentów,
  • stabilizację u 1 pacjenta,
  • pogorszenie (o ok. 20%) u pacjenta 7.[1]

Największą poprawę (20–60%) zaobserwowano u pacjentów z największą niesprawnością na początku (wysoki EDSS), umiarkowaną poprawę (5–15%) u osób z umiarkowaną niesprawnością, a najmniejszą (<5%) u pacjentów z łagodną niesprawnością. EDSS w czasie badania pozostawał zasadniczo stabilny, co sugeruje, że poprawa dotyczyła bardziej wydolności chodu niż globalnej oceny niesprawności.

Badania neurofizjologiczne i MRI

Badania potencjałów wywołanych i przewodnictwa nerwowego

Autorzy przeprowadzili szeroki panel badań neurofizjologicznych, obejmujących:

  • potencjały wywołane wzrokowe (VEP),
  • słuchowe z pnia mózgu (BAEP),
  • ruchowe (MEP),
  • somatosensoryczne (SEP),
  • laserowe potencjały bólowe (LEP),
  • oraz badania przewodnictwa nerwowego (prędkość przewodzenia, latencje, amplitudy).

Przed leczeniem większość pacjentów miała nieprawidłowości w MEP i BAEP oraz w SEP, a także zmiany sugerujące neuropatię obwodową (częściej aksonalną).

Po 12 miesiącach leczenia antyoksydantami stwierdzono:

  • istotne zmniejszenie czasu przewodzenia centralnego (CMCT) w MEP z kończyn dolnych, co interpretowano jako poprawę funkcji górnego neuronu ruchowego (ośrodkowych dróg ruchowych),
  • brak istotnych zmian w innych potencjałach wywołanych i badaniach przewodnictwa nerwowego, z wyjątkiem jednego przypadku normalizacji LEP.

Badania MRI i DTI

Pacjentów podzielono na trzy grupy pod względem obrazu MRI:

  • brak zmian patologicznych (3 pacjentów),
  • umiarkowane zmiany w drogach korowo‑rdzeniowych i okolicach przytrójkątnych (7 pacjentów),
  • wyraźne zmiany patologiczne w CST i innych strukturach (3 pacjentów).

Analiza DTI wykazała niższe wartości frakcyjnej anizotropii (FA) w drogach korowo‑rdzeniowych u wszystkich pacjentów, szczególnie u kilku z nich, ale różnice nie były statystycznie istotne. Po leczeniu nie stwierdzono wyraźnej poprawy w parametrach DTI, co sugeruje, że czas obserwacji był zbyt krótki lub zmiany strukturalne są mniej podatne na odwrócenie niż procesy funkcjonalne.

Podział pacjentów według ciężkości choroby

Wyniki pokazały, że:

  • pacjenci z cięższym obrazem klinicznym (wysoki EDSS, niski 6MWT) lokowali się w obszarze wysokich wartości markerów prozapalnych (MCP1, TNF, IL‑8),
  • pacjenci z łagodnym przebiegiem mieli wyższe poziomy IL‑10 i niższe poziomy biomarkerów prozapalnych.

To potwierdza związek między obciążeniem zapalnym a ciężkością objawów klinicznych w AMN.

Im większy spadek MCP1 między punktem M0 a M7, tym większa była poprawa dystansu w 6MWT na końcu badania.
MCP1 to białko, które przyciąga komórki odpornościowe do miejsca zapalenia. M0 oznacza moment przed leczeniem, a M7 to pomiar po 7 miesiącach badania. 6MWT to 6-minutowy test marszowy, czyli pomiar, ile metrów pacjent jest w stanie przejść w 6 minut. Mówiąc prościej: u osób, u których po leczeniu bardziej spadł sygnał zapalny MCP1, chód poprawiał się bardziej.

Niższy poziom 15S-HETE na M7 wiązał się z większą poprawą w 6MWT.
15S-HETE to jedna z cząsteczek związanych ze stanem zapalnym. M7 oznacza pomiar po 7 miesiącach. W praktyce znaczy to tyle, że im mniej było tej substancji po leczeniu, tym lepszy był wynik chodzenia w 6-minutowym teście marszowym.

Modele, które uwzględniały wynik wyjściowy 6MWT z M0 oraz zmiany MCP1 i 15S-HETE, lepiej przewidywały końcowy wynik niż sam początkowy 6MWT.
Mówiąc prościej: nie wystarczało tylko wiedzieć, jak daleko pacjent chodził na początku. Lepszą odpowiedź dawało też sprawdzenie, czy w trakcie leczenia spadały wskaźniki zapalenia, takie jak MCP1 i 15S-HETE. To pokazuje, że zmiana markerów zapalnych pomagała ocenić, kto ma większą szansę na poprawę.

Podsumowanie wyników i znaczenie badania

Badanie Casasnovas i wsp. dostarcza kilku kluczowych wniosków:

  • U dorosłych z AMN wysokie dawki kombinacji NAC, LA i witaminy E mogą istotnie zmniejszać wskaźniki stresu oksydacyjnego i zapalenia.
  • Dawka B (NAC 2400 mg, LA 600 mg, vit E 300 IU dziennie) była dawką, która konsekwentnie normalizowała większość markerów oksydacyjnych i zapalnych, podczas gdy dawka A była skuteczna tylko u jednego pacjenta.
  • Leczenie wiązało się z poprawą funkcji chodu (6MWT), szczególnie u pacjentów z cięższą niesprawnością, oraz ze spadkiem czasu przewodzenia centralnego w MEP, co sugeruje korzystny wpływ na drogi ruchowe.
  • Biomarkery, takie jak MCP1 i 15S‑HETE, wydają się dobrymi kandydatami na markery predykcyjne odpowiedzi na leczenie oraz potencjalne wskaźniki progresji choroby.
  • Terapia była bezpieczna i dobrze tolerowana w małej grupie pacjentów, co zachęca do projektowania większych, randomizowanych badań z grupą placebo (III faza).

Autorzy podkreślają, że AMN nie jest całkowicie „niezapalną” chorobą – wręcz przeciwnie, przewlekłe, niskiego stopnia zapalenie wydaje się istotnym elementem patogenezy, a modulowanie stresu oksydacyjnego i zapalenia może mieć realny wpływ na przebieg kliniczny. Wyniki wspierają koncepcję stosowania antyoksydantów jako terapii wspomagającej nie tylko w AMN, ale potencjalnie również w cięższych postaciach mózgowych X‑ALD.

SŁOWNICZEK

Produkcja energii -to jest sposób, w jaki komórka „robi prąd” dla siebie
  • W naszych komórkach są mitochondria – można je sobie wyobrazić jak małe elektrownie.
  • Z pokarmu (głównie z cukrów i tłuszczów) powstaje w mitochondriach cząsteczka ATP – to takie „bateryjki energii”, które komórka zużywa do pracy: ruchu mięśni, przewodzenia impulsów nerwowych, naprawy tkanek itd. Im lepiej działają mitochondria, tym więcej energii ma komórka i cały organizm.
Biogeneza mitochondriów- tworzenie nowych mitochondriów.
  • Komórka potrafi zwiększyć liczbę swoich elektrowni, gdy potrzebuje więcej energii, np. przy wysiłku fizycznym.
  • Wtedy uruchamia procesy, które prowadzą do powstawania nowych mitochondriów, ich „rozmnażania” i dojrzewania.

To ważne, bo jeśli mamy więcej sprawnych mitochondriów, komórki są bardziej wydolne i lepiej radzą sobie ze stresem.

Proteostaza -„Proteo” odnosi się do białek, a „staza” oznacza równowagę – proteostaza to po prostu utrzymywanie porządku w białkach komórki.

Komórka musi ciągle pilnować, żeby:

  • powstawały właściwe białka (dobrze zbudowane, w odpowiedniej ilości),
  • źle zbudowane lub zużyte białka były naprawiane albo usuwane (np. rozkładane w „rozdrabniarkach” białkowych – proteasomach).

Jeśli proteostaza się psuje, w komórce zaczynają się gromadzić toksyczne, źle złożone białka, co może prowadzić m.in. do chorób neurodegeneracyjnych.

Odpowiedź na stres retikulum endoplazmatycznego

Retikulum endoplazmatyczne (ER) to taka „fabryka i magazyn” w komórce:

  • powstają tam białka do wydzielania i wbudowania w błony,
  • syntezowane są tłuszcze (lipidy).

Stres retikulum endoplazmatycznego pojawia się, gdy w tej fabryce robi się bałagan:

  • gromadzi się zbyt dużo źle złożonych białek,
  • ER nie nadąża z ich poprawnym „składaniem”.

Komórka uruchamia wtedy specjalną reakcję – UPR (unfolded protein response), po polsku „odpowiedź na niezwinięte białka”:

  • zwalnia produkcję nowych białek,
  • zwiększa naprawę źle złożonych białek,
  • nasila ich usuwanie.

Jeśli ten stres trwa długo i komórka nie daje rady opanować sytuacji, może to prowadzić do jej śmierci i sprzyjać rozwojowi chorób (np. cukrzycy, chorób neurodegeneracyjnych).

Bibliografia:

Źródło: Casasnovas, C., Ruiz, M., Schluter, A., Naud, A., Fourcade, S., Veciana, M., Castañer, S., Albert, A., Bargalló, N., Johnson, M., Raymond, G. V., Fatemi, A., Moser, A. B., Villarroya, F., Portero-Otín, M., Artuch, R., Pamplona, R., & Pujol, A. (2019). Biomarker identification, safety, and efficacy of high-dose antioxidants for adrenomyeloneuropathy: A phase II pilot study. Acta Neuropathologica, 138, 1167–1181.

Opracowanie: dr n. społ. Anna MK